答辩博士：王莉
指导教师：方真教授
论文题目：球磨辅助低共熔溶剂解构麦秆酶解糖化及发酵产微生物油脂研究
答辩委员会
主席：
鲁植雄教授/博导 南京农业大学
委员
陈坤杰教授/博导 南京农业大学
金宏 教授/博导 南京农业大学
何春霞教授/博导 南京农业大学
周俊 教授/博导南京工业大学
黄勇 教授/博导南京林业大学
秘书
陈林 南京农业大学
答辩时间：2026年5月19日8点
答辩地点：滨江校区工学院B441会议室
论文简介
木质纤维素原料的顽抗性结构是限制其转化为生物燃料及化学品的关键瓶颈，预处理是打破这一转化瓶颈的核心环节。传统的预处理方法普遍存在环境污染、高固载量下酶解效率低、酶用量大、易产生酶解和发酵抑制物、与下游酶解及发酵等环节兼容性差等问题。针对这些问题，本研究以小麦秸秆为对象，提出球磨辅助低共熔溶剂的预处理策略，利用二者的协同作用绿色高效解构小麦秸秆，旨在低酶用量下实现高效酶解，并开发与酶解及发酵高度兼容的预处理方法。进一步，研究DES组分对纤维素酶催化酶解的调控作用，在此基础上，将富含可发酵糖的酶解液用于发酵生产微生物油脂，并结合转录组学分析，揭示DES组分促进弯曲隐球酵母油脂积累的分子机制。主要研究内容如下：
（1）系统考察了球磨辅助多种低共熔溶剂的机械化学预处理体系对麦秆酶解糖化效率及能耗、能效的影响。结果表明，经氯化胆碱/草酸体系联合球磨处理效果最佳，酶解72 h的葡萄糖和木糖得率分别达99.71%和92.77%。其强化机制在于球磨与低共熔溶剂的协同作用使木质纤维素结构疏松塌陷，促进了半纤维素和木质素的选择性脱除与结构修饰。相较于未处理原料，采用球磨与氯化胆碱/草酸体系顺序处理后，葡萄糖和木糖的相对糖化活性分别提升294.82%和658.41%，这归因于预处理后底物结晶度降低、比表面积增加以及还原端浓度提升。在顺序处理模式下，即使酶负载量低至4 FPU/g干基质，氯化胆碱/乙二醇/草酸和氯化胆碱/草酸体系预处理的葡萄糖得率仍高于80%。氯化胆碱/乙二醇/草酸体系的能效是氯化胆碱/草酸体系的1.33倍。相对糖化活性与能耗、能效之间的定量关系可分别拟合为二次函数：Y = 0.002X² − 0.83X + 91.638和Y = −2.717×10⁻⁶X² + 0.001X − 0.071。相关性曲线表明，能效在球磨时间约为2 h时达到峰值，之后随球磨时间延长呈下降趋势。
（2）探究了球磨辅助氯化胆碱/乙二醇/草酸低共熔溶剂（BM + ChCl/EG/OA）预处理对小麦秸秆高固酶解及木质素性质的影响。在优化条件（110 °C，料液比1:10（w/w），2.5 h）下，木质素去除率达82%，半纤维素去除率达99%。采用分批补料酶解策略，在纤维素酶和PEG 6000添加量分别为10 FPU/g干基质和2.5%的条件下，当固载量为30%（w/v）时，酶解72 h后酶解率仍可达82%以上；即使固载量提升至40%的极限水平，酶解120 h仍可获得78%的酶解率，相应葡萄糖及总糖浓度高达220 g/L和266 g/L。高浓度糖的实现归因于预处理有效降低了底物表面疏水性、增大了比表面积并增加了还原末端暴露，从而为纤维素酶提供了更多的攻击位点。补料策略则通过增加自由水含量、减少木质素对纤维素酶的非生产性吸附进一步提升了酶解率。酶解体系中自由水含量与酶解率之间表现出高度相关性。在分批补料体系中，二者呈显著线性正相关（R² = 0.956），PEG 6000的加入进一步强化了该相关性（R² = 0.971）；而在直接酶解体系中，二者呈现显著的二次函数关系（Y = 0.054X² - 0.73X + 50.46，R² = 0.982），进一步分析表明，体系中存在约27%的自由水临界值，维持自由水含量高于该临界值是实现高效酶解的关键前提。此外，从预处理液中可同步回收得到高纯度（97.6%）且分子量均一的优质木质素。
（3）探究球磨辅助甜菜碱/甘油/草酸体系预处理对麦秆组分分离效率及酶解糖化性能的影响。在优化工艺条件（120 ℃、3 h、固液比为1:15（w/w））下，木质素和半纤维素去除率分别达63.95%和70.02%，纤维素相对含量提升至51.56%。预处理后的底物无需水洗，在酶载量10 FPU/g干基质、底物固载量为15%（w/v）的条件下酶解，葡萄糖和木糖浓度分别达70 g/L和15 g/L，对应转化率为84%和98%，实现了酶投入与糖产出的良好平衡。进一步研究发现，在酶解体系中添加低浓度（2%~10%）甜菜碱基低共熔溶剂能显著提升葡萄糖得率，其中以添加2%甜菜碱/甘油（1:2）效果最为显著，葡萄糖得率提升至对照组的1.14倍。该促进作用与甜菜碱及甘油协同作用稳定纤维素酶蛋白结构、增强体系氢键网络及改善酶与底物界面相容性有关。经预处理后，底物比表面积提高4.40倍，还原末端浓度增加80.37%，而表面疏水性下降53.60%。同时，球磨作用诱导木质素解聚，甘油的存在则有效抑制了木质素碎片的缩合反应，最终获得结构较为完整且纯度高达95.08%的木质素组分，为其后续功能化利用提供了理想原料。
（4）探究甜菜碱添加对弯曲隐球酵母利用酶解液发酵生产油脂的影响及作用机制。以纯糖培养基为碳源发酵时，不同浓度甜菜碱的添加均能促进菌体增殖与油脂积累，当添加量为1.5 g/L、C/N为71时，油脂合成效果最佳，油脂产量达9.48 g/L，油脂含量为59.36%。与传统氮源硫酸铵（C/N为107）相比，添加0.5 g/L甜菜碱（C/N为104）可使油脂产量和含量分别提升12.29%和11.58%。在酶解液发酵体系中，添加1.5 g/L甜菜碱同样显著提升了油脂合成效率。利用BM + ChCl/EG/OA预处理的酶解液发酵时，发酵后生物量达到15.90 g/L，油脂产量为9.18 g/L，油脂含量高达57.76%。机制研究表明，甜菜碱通过促进菌体生长并维持发酵体系pH稳定，从而有利于油脂积累。转录组分析进一步揭示，甜菜碱通过上调核心碳代谢途径（丙酮酸代谢和乙醛酸循环）以及氨基酸代谢通路（如蛋氨酸和丝氨酸代谢），为脂肪酸合成提供充足的前体物质和还原力。同时，通过下调糖酵解/糖异生与戊糖磷酸途径等非必需通路，减少了碳源的非必需代谢消耗，将代谢流高效引导至脂肪酸合成过程。
综上所述，本研究构建的球磨辅助低共熔溶剂预处理策略，成功实现了小麦秸秆的高效解构。并结合分批补料酶解，不仅获得了高浓度可发酵糖液，还回收了高纯度木质素。同时揭示了DES组分在后续酶解及发酵中的积极作用及作用机制，利用酶解液生产出了与大豆油组成相近的微生物油脂，为小麦秸秆的高值化利用提供了理论支撑和技术参考。
主要创新点如下：
（1）在高固载（40% w/v）、低酶用量（10 FPU/g干基质）条件下，首次实现了高达220 g/L的葡萄糖浓度和266 g/L总糖浓度的优异糖产出性能，同时联产高纯度（98%）的木质素，体现了工艺的高效性与经济性。
（2）构建了一种绿色环保的甜菜碱基低共熔溶剂，该体系在有效解构木质纤维素的同时，其主要组分甜菜碱和甘油兼具维持纤维素酶活性与稳定性的功能。因此，经该体系预处理后的底物无需繁琐水洗即可直接进行酶解，实现了预处理与酶解过程的高效兼容。这为发展高效、低成本的一站式生物炼制提供了新思路。
（3）本文首次揭示了甜菜碱促进弯曲隐球酵母油脂积累的新功能，并通过转录组测序手段，从分子层面揭示了甜菜碱通过协调糖代谢与脂质合成相关基因的表达，共同调控碳流分配的潜在分子机制。
