答辩博士：董倩
指导老师：方真教授
论文题目：冷冻结合碱盐预处理稻秆高效制糖及其发酵产微生物油脂研究
答辩委员会：
主席：
鲁植雄 教授/博导 南京农业大学
委员：
陈坤杰 教授/博导 南京农业大学
何春霞 教授/博导 南京农业大学
金宏 教授/博导 南京农业大学
周俊 教授/博导 南京工业大学
黄勇 教授/博导 南京林业大学
秘书：
陈林 南京农业大学
答辩时间：2026年5月19日8点00
答辩地点：滨江校区工学院B441会议室
论文简介：
作为可再生资源，农作物秸秆在推动清洁能源转型和实现净零碳排放目标方面潜力巨大。然而，其复杂的木质纤维结构及高度的生物顽抗性限制了能源转化效率。本研究目的是冷冻预处理秸秆糖化发酵产微生物油脂为生物柴油提供原料。首先，以稻秆为研究对象，开发了以冷冻处理为主、碱盐和水热处理为辅的组合预处理方法，以实现稻秆的高效解构；同时，构建了孔隙水的结晶应力模型，并结合溶液冻结引起的体积膨胀效应，以阐述木质纤维素在水冷冻与碱盐冷冻过程中的冻胀损伤机制。在此基础上，优化酶解工艺，制备适用于酵母Cryptococcus curvatus产脂的高品质碳源。
研究的主要内容和成果包括：
（1）冷冻预处理对木质纤维素结构的损伤机理研究。基于热力学平衡原理，构建了孔隙水的结晶均化应力模型，明确影响应力的主要因素包括冷冻温度、孔隙特征（孔隙率与表面积）及孔隙水饱和度。冷冻温度对冻胀损伤起主导作用并决定冻胀变形的上限；孔隙水饱和度决定损伤能否触发及损伤程度；应力随冷冻温度降低与孔隙水饱和度升高而增大。在水冷冻处理过程中，冰晶体积膨胀扩大固有开孔、诱发次生孔隙并连通闭口孔，使水稻茎秆的孔隙率、比表面积和饱和度同步提升。孔隙水冻结所产生的结晶应力为22.5~38.3 MPa，显著高于茎秆的平均屈服应力（3.0 MPa），从力学上证实水冷冻可有效引发冻胀损伤，且损伤主要源于孔隙水冻结的体积膨胀。进一步研究表明，在-20 ℃冷冻12 h条件下，碳酸钠溶液（pH 11）的体积膨胀率较去离子水提高3.4%，因而产生更显著的结构损伤。相较水冷冻，碳酸钠冷冻预处理稻秆的比表面积和孔容分别提高0.3~1.2 m2/g和0.6~1.0×10-3 cm3/g。碳酸钠冷冻预处理对稻秆未造成明显的化学损伤，物理损伤的增强归因于孔隙水冻结产生的体积膨胀与碱盐溶液渗透压的协同作用。
（2）为验证水冷冻预处理的适用性，建立了稻秆的水冷冻结合碱盐水热预处理方法。水冷冻预处理使稻秆结构疏松，表面出现裂隙与孔洞，比表面积增加1.2倍，提升了试剂可及性，但对组分分离和酶解效率的影响不显著。经水冷冻结合碱盐水热预处理（-20 ℃冷冻4次；190 ℃、60 min、0.4 mol/L Na2CO3、固液比1:10）后，预处理稻秆中纤维素和半纤维素回收率分别为97.2%和62.1%，木质素去除率达72.0%。预处理稻秆结构疏松多孔，比表面积增加2.2倍，显著提升纤维素和半纤维素的酶可及性。在酶载量10 FPU/g底物、底物浓度5%（w/v）下水解24 h，预处理稻秆的葡萄糖和木糖得率分别达到91.1%和67.6%；添加吐温80（50 mg/g底物）可减少酶的非生产性吸附，使二者分别增至96.9%和68.6%。当吐温80浓度增至100 mg/g底物可实现预处理稻秆的高浓底物（20%，w/v）糖化，酶解72 h后葡萄糖和木糖得率分别为69.8%和52.4%。采用分批补料策略（初始底物浓度5%（w/v），分别在4、8和12 h补加5%（w/v）底物）可缩短酶解时间至48 h，葡萄糖和木糖得率分别增至88.4%和59.4%，酶解液中二者浓度分别达到80.8 g/L和26.8 g/L。
（3）为简化预处理步骤、降低处理强度与成本，采用碱盐冷冻结合水热方法对稻秆进行预处理。经碳酸钠冷冻结合水热预处理（0.6 mol/L Na2CO3、固液比1:15、-20 ℃冷冻2次；121 ℃、30 min）后，稻秆纤维素和半纤维素的保留率分别达97.6%和87.5%，木质素去除率为74.8%。预处理稻秆在10 FPU/g底物、5%（w/v）底物下水解72 h，其葡萄糖和木糖得率分别由原始稻秆的10.9%和2.4%增至98.1%和68.5%。经磷酸钾冷冻结合水热预处理（0.4 mol/L K3PO4、固液比1:15、-20 ℃冷冻3次；121 ℃、30 min）后，稻秆纤维素和半纤维素的回收率分别为97.1%和78.8%，木质素去除率达86.9%，葡萄糖和木糖得率分别为91.1%和69.0%。碱盐冷冻结合水热预处理可有效破坏稻秆的物理屏障及木质素-碳水化合物复合结构，使其致密结构疏松、比表面积和孔径增大，从而显著提高碳水化合物对纤维素酶的可及性。通过响应面法进一步优化酶解条件，碳酸钠或磷酸钾冷冻结合水热预处理稻秆的最适酶解条件分别为8%（w/v）底物、8 FPU/g底物或7%（w/v）底物、10 FPU/g底物，吐温80浓度均为110 mg/g底物，酶解72 h后葡萄糖得率分别为95.3%和100%，木糖得率分别为73.6%和81.1%，较原始稻秆分别提高73.3%和86.2%（葡萄糖），69.0%和75.7%（木糖）。进一步采用分批补料策略（初始底物浓度7%（w/v），分别在4和8 h补加7%和6%（w/v）底物），在低酶载量（10 FPU/g底物）和高浓底物（20%，w/v）条件下实现预处理稻秆的高效糖化，其葡萄糖和木糖得率高达83.4%和66.3%，酶解液中二者浓度分别为111.4 g/L和36.3 g/L，可作为微生物油脂发酵的优质碳源。
（4）分别以模拟混糖和磷酸钾冷冻结合水热预处理稻秆的酶解产物为碳源，培养酵母产微生物油脂。首先在葡萄糖与木糖混合模拟培养基中优化培养条件与培养基组分，考察接种量、装液量、温度和转速及糖浓度、氮源和吐温80等对酵母细胞生长与油脂积累的影响。在最适培养条件（接种量8%（v/v）、装液量20%（v/v）、28 ℃、200 rpm）与培养基组分（g/L：葡萄糖28、木糖11、酵母浸粉2、氯化铵0.1，KH2PO4 2.7、Na2HPO4·12H2O 2.4、MgSO4·7H2O 0.34、MnCl2 0.2）下培养6天，酵母细胞干重、油脂产量、胞内油脂含量和油脂产率分别为14.6 g/L、6.0 g/L、41.1%和0.175 g/g。在发酵培养基中添加5.5 g/L吐温80，可通过调控微生物生理代谢促进酵母细胞生长和油脂积累，使细胞干重、油脂产量、胞内油脂含量和油脂产率分别增至14.7 g/L、7.4 g/L、50.5%和0.199 g/g。以预处理稻秆的酶解产物为碳源进行发酵，细胞干重（18.6 g/L）高于混糖模拟培养基的15.2 g/L，但油脂产量、含量和产率分别由7.7 g/L、50.4%和0.210 g/g降至7.3 g/L、39.1%和0.198 g/g。100 g稻秆经预处理、酶解和发酵后可获得7.0 g油脂，其组分和与大豆油相似，可作为生产生物柴油的潜在原料。
主要创新点如下：
（1）首次通过构建孔隙水结晶均化应力模型以阐述水冷冻预处理对木质纤维素的冻胀损伤机制；并通过实验和表征手段进一步揭示碱盐冷冻预处理对木质纤维素的损伤破坏是由体积膨胀和渗透压协同作用所致。
（2）建立冷冻结合碱盐预处理方法，实现稻秆组分的高效选择性分离，并显著提升其在低酶载量和高底物浓度条件下的糖化效率。
（3）在优化发酵培养基组分和培养条件下，以预处理稻秆的酶解产物为碳源培养产油酵母C. curvatus，实现微生物油脂的高效生产。
