答辩博士：郭静静
指导老师：方真教授
论文题目：固定化脂肪酶催化高酸值废油一步法制备生物柴油的研究
答辩委员会：
主席：
肖茂华 教授/博导 南京农业大学
委员：
丁为民 教授/博导 南京农业大学
何春霞 教授/博导 南京农业大学
庄 伟 教授/博导 南京工业大学
周 俊 教授/博导 南京工业大学
秘书：
曹 阳 南京农业大学
答辩时间：2025年5月16日13点30分
答辩地点：滨江校区12号楼B422
论文简介：
在碳中和时代和全球能源需求持续增长的背景下，研究替代能源势在必行。生物柴油（即脂肪酸甲酯）由于其可再生性和与柴油相似的特性，被认为是最有前景的替代能源之一。然而，高昂的生产成本阻碍了其在世界上大部分地区的商业化应用。为了实现生物柴油的清洁和经济化生产，开发价格低廉的非食用原料油和可回收的高效生物催化剂十分必要。本文探究了废弃高酸值美洲大蠊油作为生物柴油原料油的可行性，开发了可再生磁性生物炭固定化脂肪酶，探索了脂肪酶同时催化酯化和酯交换反应的反应规律和反应机理。同时，开发了一种低共熔溶剂体系中酶法同时生产和纯化生物柴油的工艺，并利用密度泛函理论计算揭示了低共熔溶剂促进酯化/酯交换反应和生物柴油纯化的机理。该研究为脂肪酶一步法生产高酸值废油生物柴油的工业化应用提供了一定的理论基础，主要研究内容和结果如下：
（1）为了开发新型生物柴油原料并实现高酸值废油生物柴油的一步法制备，以未被开发的高酸值美洲大蠊油为原料，利用液体脂肪酶同时催化酯化和酯交换反应制备生物柴油。通过液体脂肪酶的筛选发现脂肪酶Eversa® Transform 2.0在同时催化酯化和酯交换反应中表现出较高的催化活性（生物柴油产率93.9%，12 h）。以美洲大蠊幼虫油（酸值为21.9 mg KOH/g）为原料，通过响应面实验优化得到了液体脂肪酶Eversa® Transform 2.0制备生物柴油的最佳反应条件为8.5 wt.%液体酶量、32 °C、6.5/1醇/油摩尔比、4 wt.%加水量和8 h。在最优反应条件下，生物柴油产率为98.6%，酸值为4.2 mg KOH/g。以美洲大蠊药渣油（酸值为38.3 mg KOH/g）为原料，生物柴油产率和酸值也分别可达97.2%和4.7 mg KOH/g。通过放大实验（400 g底物油，25 mL反应器扩大到1 L反应器）发现生物柴油的产率仍可达93.9%。此外，在4 °C下储存90天，脂肪酶Eversa® Transform 2.0的活性几乎保持不变（~30 U）。这表明液体脂肪酶Eversa® Transform 2.0在生物柴油制备中具有潜在的工业化应用前景。动力学研究表明该反应的活化能为24.50 kJ/mol，动力学米氏常数为1.19 mol/L。通过动力学研究发现4 wt.%加水量是维持脂肪酶催化活性所必需的，并且该体系中水解反应可忽略不计。此外，液体脂肪酶Eversa® Transform 2.0可以同时催化甘油酯的酯交换反应和游离脂肪酸的酯化反应，实现一步法制备高酸值废油生物柴油。纯化的生物柴油的理化指标均符合GB/T 25199和ASTM D6751标准要求，这表明高酸值美洲大蠊油可以作为潜在的生物柴油原料。通过生命周期评估发现液体脂肪酶Eversa® Transform 2.0催化高酸值废油生产生物柴油是一种清洁、环保和节能的工艺。
（2）为了实现液体脂肪酶的分离回收和降低固定化载体的成本，通过低温水热（275 °C）可再生的羧甲基甲壳素/高铁酸钾螯合物制备了具有较强磁饱和度（56.2 emu/g）的磁性水热生物炭，并用于吸附固定化脂肪酶Eversa® Transform 2.0。K2FeO4可以同时活化和磁化生物炭。磁性水热生物炭的孔径和比表面积分别增加至7.2 nm和84.1 m2/g从3.1 nm和15.2 m2/g（水热生物炭），酶载量上升至34.9 mg/g从25.1 mg/g（水热生物炭）。通过单因素实验得到了磁性水热生物炭吸附固定化脂肪酶的最佳条件，在25 °C、pH 7、10 h、5 mg/mL酶浓度的条件下，磁性水热生物炭的酶载量为39.6 mg/g，酶活为15.6 U/g。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶对极端温度（50 °C）和pH（9）具有更强的抗性，其相对酶活可以保持在80%以上。在4 °C储存30天，固定化脂肪酶的相对酶活仍保持在90.5%。在对硝基苯棕榈酸酯体系中，固定化脂肪酶在第6次循环中仍保持了60.7%相对酶活。固定化脂肪酶制备高酸值废油（美洲大蠊药渣油）生物柴油的最佳条件为7/1醇/油摩尔比、15 wt.%固定化酶量、4 wt.%加水量、35 ℃、26 h。在最佳反应条件下，生物柴油产率和酸值分别为98.7%和4.5 mg KOH/g（美洲大蠊油酸值为38.3 mg KOH/g），这表明该固定化脂肪酶可以同时催化游离脂肪酸的酯化反应和甘油酯的酯交换反应。磁性水热生物炭吸附固定化脂肪酶回收5次，生物柴油产率为75.2%，实现了液体脂肪酶Eversa® Transform 2.0的分离回收。
（3）为了进一步提高磁性生物炭载体的酶载量和固定化脂肪酶的回收稳定性，通过一步热解可再生的羧甲基纤维素/Fe3+螯合物制备了磁性热解生物炭，柠檬酸/戊二醛功能化后用于共价固定化脂肪酶Eversa® Transform 2.0。研究发现400 °C热解20 mg/mL羧甲基纤维素/Fe3+螯合物可以为磁性热解生物炭提供较高的磁性（21.7 emu/g）、更大的孔径（20.6 nm）和更高的酶载量（75.8 mg/g）。磁性热解生物炭共价固定化脂肪酶的最佳条件为6 mg/mL酶浓度、pH 7、25 °C、11 h。此时，磁性热解生物炭的酶载量为91.3 mg/g，酶活为19.2 U/mg，其酶载量比上一章磁性水热生物炭吸附固定化酶（39.6 mg/g）提高了130%。磁性热解生物炭共价固定化脂肪酶有序结构的增加（β折叠结构占比从27%增加到了44%）有利于增强脂肪酶Eversa® Transform 2.0对环境变化的抗性。与游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶具有更强的耐高温性，耐pH性和储存稳定性。利用响应面法实验得到了固定化脂肪酶制备高酸值废油（美洲大蠊药渣油）生物柴油的最佳反应条件，在14 wt.%固定化酶量、7/1醇/油摩尔比、33 °C、4 wt.%加水量、14 h、250 rpm转速的条件下，生物柴油的产率和酸值分别为95.7%和4.2 mg KOH/g。动力学研究表明该反应主要受动力学控制，没有外部和内部传质限制。磁性热解生物炭共价固定化脂肪酶同时催化酯化和酯交换反应的活化能为28.7 kJ/mol，动力学米氏常数和最大反应速率分别为8.55×10-1 mol/L和5.05×10-3 mol/(L·min)。固定化脂肪酶经磁性回收10次，生物柴油产率仍高达85.7%。与上一章磁性水热生物炭吸附固定化脂肪酶（5次循环，75.2%生物柴油产率）相比，该固定化脂肪酶（5次循环，92.7%生物柴油产率）具有较强的循环稳定性。
（4）为了实现高酸值废油生物柴油的同时生产和纯化，通过复合硅烷疏水改性磁性生物炭以直接激活脂肪酶，并利用低共熔溶剂去除反应过程中的游离甘油和水，促进酯化/酯交换反应和生物柴油纯化。通过脂肪酶的筛选发现脂肪酶Eversa® Transform 2.0和脂肪酶Candia antarctica B分别具有较强的催化酯交换和酯化反应的活性。与磁性生物炭相比，复合脂肪酶Eversa® Transform 2.0/Candia antarctica B固定化在磁性疏水生物炭上的酶活较高（16.1 U/mg），酶载量较大（37.3 mg/g），这表明磁性疏水生物炭在固定化过程中可以直接打开脂肪酶的活性中心。固定化复合脂肪酶比单一固定化脂肪酶的酶活分别提高了3.9%（Eversa® Transform 2.0）和8.1%（Candia antarctica B）。磁性疏水生物炭固定化复合脂肪酶的最佳条件为pH 6、30 °C、4 mg/mL酶浓度和4 h。此时，磁性疏水生物炭的酶载量为39.5 mg/g，酶活为17.9 U/mg。固定化复合脂肪酶的耐高温性、耐pH性、储存稳定性和回收稳定性均高于游离复合脂肪酶。固定化复合脂肪酶同时生产和纯化高酸值废油（美洲大蠊药渣油）生物柴油的最佳反应条件为250 rpm转速、35 °C、15 wt.%加酶量、150 wt.%低共熔溶剂添加量、5/1醇/油摩尔比、24 h。在最优反应条件下，生物柴油产率为97.9%，酸值和游离甘油含量分别为0.27 mg KOH/g和0.015%，符合GB/T 25199和ASTM D6751标准。利用密度泛函理论计算证明了低共熔溶剂和生物柴油中水/甘油之间存在氢键相互作用、范德华力以及正负电荷吸引相互作用，可以去除反应过程中的游离甘油和水，从而促进酯化和酯交换反应和纯化。此外，固定化复合脂肪酶循环5次，生物柴油产率仍高达75.2%。采用化工流程模拟软件Aspen Plus建立了固定化复合脂肪酶在低共熔溶剂中同时生产和纯化生物柴油的工艺流程，生物柴油的产率为98.2%，精馏得率为99.8%，酸值和游离甘油含量分别为0.36 mg KOH/g和0%。低共熔溶剂中固定化复合脂肪酶同时生产和纯化生物柴油工艺具有工业化应用的可行性。
主要创新点如下：
（1）本文首次以一种未被开发的高酸值美洲大蠊油为生物柴油原料油，开发了脂肪酶一步法高效制备高酸值废油生物柴油的工艺。基于热力学-动力学模型，探究了脂肪酶同时催化酯化和酯交换反应的反应规律和反应机理。
（2）本文开发了廉价、绿色的磁性生物炭-酶载体。首次提出通过水热/热解可再生生物质（羧甲基甲壳素、羧甲基纤维素钠）和铁盐制备磁性生物炭，并用于吸附/共价固定化脂肪酶，实现了液体脂肪酶的分离回收，改善了游离脂肪酶的稳定性。
（3）本文开发了一种酶法同时生产和纯化高酸值废油生物柴油的工艺。首次利用复合硅烷疏水改性磁性生物炭载体以直接激活脂肪酶，并利用DES去除反应体系中的游离甘油和水，促进酯化/酯交换反应和生物柴油的纯化。通过DFT计算在分子尺度上揭示了DES和粗生物柴油中水/甘油之间的相互作用。
